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避免RNA降解的注意事項

1. 使用正確的細(xì)胞或組織儲存條件 

在樣品用液氮瞬間凍結(jié)之后，應(yīng)該儲存在-80°C，千萬不能解凍。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍，也會導(dǎo)致 RNA 的降解和損失。瞬間凍結(jié)的組織應(yīng)該首先在超低溫條件下先研磨成粉，然后置于裂解液中進(jìn)行勻漿。RNAfixer 使樣品儲存更為便利。儲存在 RNAfixer 中的細(xì)胞或組織可在室溫下穩(wěn)定保存長達(dá) 1 個星期，在 4°C 可穩(wěn)定保存長達(dá)1 個月，或**保存在-20°C。 

2. 消除環(huán)境 RNase 的污染 

為了得到完整的、高品質(zhì) RNA，在整個 RNA 制備過程中，當(dāng) RNA 離開強(qiáng)蛋白變性劑（如離液裂解液或酚）的保護(hù)時，避免引入新的 RNase 污染就非常關(guān)鍵。由于 RNase 幾乎是**，所以必須確保與純化的 RNA 接觸的每一樣?xùn)|西都是無 RNase 污染的。所有的表面，包括移液器、工作臺、玻璃器皿和制膠設(shè)備，都必須用表面去污凈化溶液如 RNase 噴霧清除劑來處理過，去除各種溶液或者反應(yīng)緩沖液中可能存在的 RNase 污染，可以用 RNAsafe。必須保證一直使用無 RNase 的槍頭、試管和溶液，手套也應(yīng)經(jīng)常更換。 

3. 迅速滅活內(nèi)源的 RNA 酶，以防止 RNA 降解 

以下 3 個方法均可有效使內(nèi)源 RNA 酶失活： 

1）用含離液（如胍鹽）的細(xì)胞裂解液收獲樣品，并立即勻漿。 

2）用液氮瞬間凍結(jié)樣品。值得特別注意的是：組織塊必須保證足夠小，在浸入液氮的瞬間

就能凍結(jié)，以確保瞬間令 RNA 酶失活。 

3）立即將樣品置于 RNAfixer 無液氮 RNA 樣品儲存液中。它是一種水相、無毒的收集試劑，

能立即穩(wěn)定并保護(hù)完整、未凍結(jié)的組織和細(xì)胞樣品中的 RNA。關(guān)鍵要點(diǎn)是組織樣品切片一定要夠薄（<0.5 cm），這樣 RNAfixer 才能在 RNase 破壞 RNA 之前迅速滲入組織塊中。                                               

4.選擇合適破壁方法 

細(xì)胞或組織的*勻漿對 RNA 提取來說，是一個很關(guān)鍵的步驟，它能夠防止 RNA 的損失和降解。勻漿的方法應(yīng)根據(jù)細(xì)胞或組織的類型來選擇。大部分培養(yǎng)的細(xì)胞可以置于細(xì)胞裂解液中，通過簡單的渦旋震蕩來勻漿；而動物組織、植物組織、酵母和細(xì)菌、真菌則常常需要更加劇烈的方法，通常用液氮研磨。比如說細(xì)菌（特別是革蘭氏陽性菌）的細(xì)胞壁，就需要溶菌酶消化來實(shí)現(xiàn)*的細(xì)胞裂解和 RNA 的最大回收，酵母提取時加入破壁酶幫助破壁。 

5.選擇最適 RNA 提取試劑（盒） 

現(xiàn)有眾多的 RNA 分離方法也許令人難以取舍。目前**也是**的方法是柱式分離，也就是結(jié)合基于 Trizol 原理的裂解液和硅膠膜吸附柱的使用，是目前比較通用的一種方法。

對于動物細(xì)胞，組織，植物葉片等常用材料都基本適用。植物 RNA 的提取比較難抉擇，像根和果實(shí)等，由于多糖，多酚物質(zhì)的存在，很難純化；還有就是血清等液體樣本的提取，水分多或者 RNA 含量少等，較難提取。可以采用針對性的試劑（盒） 

6. 低濃度 RNA 的沉淀 

純化得到的 RNA 可能需要通過沉淀來濃縮，以滿足一些下游應(yīng)用的需要。醋酸銨(NH4OAc) 沉淀（加 0.1 體積的 5M  醋酸銨、2-2.5 體積的無水乙醇，-20°C 放置 25 分鐘以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如  linear acrylamide 糖原 glycogen,酵母 yeast  RNA）的方法。核酸助沉劑是 linear  acrylamide，當(dāng)RNA 用于 RT-PCR 分析時，線性的丙烯酰胺和 DNase 處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑，因?yàn)樗鼈兌疾缓?DNA 污染，糖原含量高會抑制 PCR 反應(yīng)，應(yīng)注意控制濃度，核酸助沉劑對 PCR 無影響，成為病毒核酸提取的**。酵母 RNA 和未處理的糖原會給樣品帶來核酸污染，有可能影響 RT-PCR 的結(jié)果。沉淀后，注意避免 RNA 沉淀過分干燥，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致很難重新溶解。 

7.提取好的 RNA 如何儲存 

RNA 最好是提取完成后，立刻進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。如果只是短期儲存，重懸的 RNA 應(yīng)放置于-20°C；如果是長期儲存的話，就應(yīng)該放置于-80°C。儲存 RNA 時，可以加入少量的 RNA酶抑制劑防止 RNA 的降解。 

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